Evaluación de eficacia y seguridad de una solución de dióxido de cloro….
En este estudio, se produjo una solución de dióxido de cloro (UC-1) compuesta por dióxido de cloro mediante un método electrolítico y posteriormente se purificó mediante una membrana. Se determinó que UC-1 contenía 2000 ppm de dióxido de cloro gaseoso en el agua. Se evaluaron la eficacia y la seguridad de UC-1. La actividad antimicrobiana tuvo una reducción de más del 98,2 % cuando las concentraciones de UC-1 fueron de 5 y 20 ppm para bacterias y hongos, respectivamente. La mitad de las concentraciones inhibitorias máximas (IC 50) de H1N1, virus de influenza B/TW/71718/04 y EV71 fueron 84,65 ± 0,64, 95,91 ± 11,61 y 46,39 ± 1,97 ppm, respectivamente. Una prueba de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) reveló que la viabilidad celular de las células L929 de fibroblastos de pulmón de ratón era del 93,7 % a una concentración de UC-1 de 200 ppm que supera la prevista en el uso rutinario. Además, 50 ppm de UC-1 no mostró síntomas significativos en una prueba de irritación ocular en conejos. En una prueba de toxicidad por inhalación, el tratamiento con 20 ppm de UC-1 durante 24 h no mostró anormalidad ni mortalidad en los síntomas clínicos y el funcionamiento normal del pulmón y otros órganos. A ClO2concentración de hasta 40 ppm en agua potable no mostró ninguna toxicidad en una prueba de toxicidad oral subcrónica. Aquí, UC-1 mostró una actividad de desinfección favorable y una tendencia de perfil de seguridad más alta que en informes anteriores.
Palabras clave: dióxido de cloro (PubChem CID: 24870), eficacia antimicrobiana, ensayo antiviral, toxicidad por inhalación, toxicidad oral subcrónica
1. Introducción
El dióxido de cloro, un oxidante fuerte, puede inhibir o destruir microbios [ 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ]. Los estudios han investigado la aplicación de dióxido de cloro en numerosos campos, como el tratamiento de aguas o aguas residuales, la desinfección del medio ambiente y de los alimentos, y la medicina [ 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 ]. Por lo general, el dióxido de cloro se produce utilizando un método electrolítico o a base de ácido [ 7 , 8 , 10 , 12]. En el método basado en ácido, el dióxido de cloro se produce mezclando materiales de partida, como clorito de sodio y ácido clorhídrico, clorito de sodio y tricloruro férrico, o clorito de sodio y cloro gaseoso. En el método electrolítico, los reactivos son cloruro de sodio acuoso o solución salina saturada e hipoclorito de sodio.
De acuerdo con la regla de desinfectantes y subproductos de la desinfección (DBPR) del Manual de orientación sobre el cumplimiento simultáneo de las reglas sobre microbios y subproductos de la desinfección de la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos [ 14 ], los objetivos de nivel máximo de desinfectante residual (MRDLG) y los niveles máximos de desinfectante residual ( MRDL) de cloro dióxido son 0,8 mg/L [ 14 ]. Los límites de exposición permisibles (PEL) para el dióxido de cloro definidos por la Administración de Seguridad y Salud Ocupacional son los siguientes: (a) Industria general: 0,1 ppm y 0,3 mg/m 3 ; (b) Industria de la construcción: 0,1 ppm y 0,3 mg/m 3 promedio ponderado en el tiempo (TWA); (c) Valor límite umbral de la Conferencia Estadounidense de Higienistas Industriales Gubernamentales: 0,1 ppm y 0,28 mg/m 3TWA; 0,3 ppm y 0,83 mg/m 3 límite de exposición a corto plazo (STEL); (d) Límite de exposición recomendado por el Instituto Nacional para la Seguridad y Salud Ocupacional: 0,1 ppm TWA; 0,3 ppm STEL.
La aplicación de productos de dióxido de cloro o su contacto con los alimentos o el cuerpo humano es un problema grave si los productos contienen altos niveles de impurezas. Las impurezas son causadas principalmente por reactivos impuros como 10% H 2 SO 4 y 15% NaClO 2 o subproductos de reacción como Cl 2 y anión cloroxi. Por ejemplo, H 2 SO 4 al 10 % y NaClO 2 al 15 % contienen 90 % y 85 % de impurezas desconocidas, respectivamente. El producto de dióxido de cloro obtenido de una mezcla de 10% H 2 SO 4 y 15% NaClO 2 es altamente impuro. El Cl 2El producto puede reaccionar con la materia orgánica para formar trihalometano, que es cancerígeno. Los aniones cloroxi, como ClO 2 − o ClO 3 − , pueden ser perjudiciales para la salud humana [ 15 ].
El uso doméstico e industrial del dióxido de cloro debe evaluarse de acuerdo con la pureza del producto, para lo cual el método de preparación es un paso fundamental. Los materiales de partida de baja pureza (p. ej., HCl al 5 % y NaClO 2 al 10 % ) tienen un alto contenido de impurezas. Si el producto de estas reacciones no se purifica más, entonces los productos de dióxido de cloro producidos, que también contienen altos niveles de impurezas, son útiles solo para el tratamiento de aguas residuales y no son aptos para el contacto con humanos o alimentos debido a las impurezas dañinas. Por lo tanto, se debe obtener un mayor porcentaje de moléculas de dióxido de cloro gaseoso a través de una mayor purificación de moléculas de dióxido de cloro gaseoso.
Para aumentar la seguridad de la solución de dióxido de cloro, eliminar o reducir las impurezas y aumentar la concentración de dióxido de cloro gaseoso en una solución es un enfoque razonable. Aquí se diseñó e implementó un proceso limpio y concentrado para la producción de dióxido de cloro gaseoso. Producimos una solución de dióxido de cloro (UC-1) que contiene 2000 ppm de dióxido de cloro gaseoso en agua a través del método electrolítico. La solución se purificó adicionalmente con una membrana de película y posteriormente se disolvió en agua de ósmosis inversa (OI). Se investigó UC-1 para determinar su eficacia y se evaluaron cuestiones de seguridad como la actividad antimicrobiana, la citotoxicidad in vitro, la irritación ocular en conejos in vivo, la toxicidad por inhalación in vivo y la toxicidad oral subcrónica in vivo.
2. Materiales y métodos
2.1. Método electrolítico para la producción de dióxido de cloro gaseoso
La solución UC-1 se produce en un aparato cuyos detalles técnicos se publicarán más adelante en forma de solicitud de patente (PCT solicitada PCT/CN2016/080198; PCT solicitada PCT/CN2016/080199; PCT solicitada PCT/CN2015/ 099515; DE202016103175) por un método electroquímico. Brevemente, la solución de cloruro de sodio se preparó a partir de 99% de cloruro de sodio (grado alimenticio) y agua RO y se bombeó al equipo de electrobaño. La electrólisis fue operada por 6–12 V y 40–80 A de corriente. Después de la electrólisis, el gas ClO 2 se mezcló con agua utilizando un mezclador agua-ClO 2 que fue diseñado en base al efecto Venturi. El ciclo continuó mezclando agua con gas ClO 2 hasta que la concentración de ClO 2 en el agua superó las 2000 ppm (Figura 1) y el valor de pH fue de 2,2. La solución de dióxido de cloro producida por este proceso se denomina UC-1.
Diagrama de flujo de la producción de solución de dióxido de cloro.
La composición química de la solución UC1 se determinó de acuerdo con un método estándar [ 16 ]. Se obtuvieron los siguientes datos: ClO 2 : 2120 ppm, cloro libre (Cl 2 ): 882 ppm y cloro total (Cl 2 + HOCl + OCl − ): 900 ppm. La concentración de cloro total es algo mayor que en el caso de otros generadores de ClO 2 porque el electrolito que aplicamos no contiene nada de NaClO 2. La solución UC-1 se produjo usando solo una solución de NaCl al 25 %, sin ningún otro aditivo, lo cual es una ventaja obvia. Al mismo tiempo, a pesar del mayor contenido de cloro total (que está presente en las soluciones diluidas de UC-1 principalmente como HOCl), no se observaron efectos adversos detectables en los animales de prueba ni en los tejidos animales.
2.2. Prueba de eficacia antimicrobiana
La prueba se realizó siguiendo las Pruebas microbiológicas 34 NF29/<51> de la Farmacopea de EE. UU. [ 17 ]. Pruebas de eficacia antimicrobiana. Los organismos de prueba fueron los siguientes: Escherichia coli (BCRC 11634/ATCC 8739), Staphylococcus aureus (BCRC 10451/ATCC 6538P), Pseudomonas aeruginosa (BCRC 11633/ATCC 9027), S. aureus subsp. aureus (BCRC 15211/ATCC 33591), subespecie Bacillus subtilis . (BCRC 10447/ATCC 6633), Listeria monocytogenes (BCRC 14848/ATCC 19114), Acinetobacter baumannii (BCRC 10591/ATCC 19606), subespecie de Salmonella enterica . (BCRC 12947/ATCC 13311), Klebsiella pneumoniae(BCRC 16082/ATCC 4352), Penicillium funiculosum (BCRC 30438/ATCC 11797) y Candida albicans (BCRC 21538/ATCC10231).
2.3. Ensayo antiviral
Los virus se amplificaron en células MDCK/RD. Se cultivaron células MDCK/RD en medio de Eagle modificado por Dulbecco con suero bovino fetal al 10% (FBS DMEM). Cuando las células alcanzaron una confluencia del 90%, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se infectaron con una multiplicidad de infección de 0,01. Después de la infección, se añadió FBS DMEM al 0 % y las células se incubaron a 35 °C en una incubadora con CO2 al 5 % durante 48 h.
Se cargó una suspensión celular de 1 ml (6 × 10 5 células) en cada pocillo de una placa de 6 pocillos, que se incubó a 37 °C durante 18–24 h. Se usó PBS para diluir UC-1 a concentraciones finales de 0, 25, 50, 100 y 200 ppm en pocillos que reaccionaron con células y virus durante 2 min a 37 °C. Después de la reacción, la mezcla de reacción total se diluyó a 10-8 . Posteriormente, el 10 −8la mezcla de dilución se incubó a 37 °C durante 48–64 h. Las células se fijaron con formalina al 10 % durante 1 h y se tiñeron con cristal violeta al 0,1 % durante 5 min. Se contó el número de placas formadas por virus y se comparó entre los grupos de prueba y de control. La actividad antiviral se muestra como el porcentaje de control de virus = placas en el grupo de prueba/placas en el grupo de control × 100. El control de virus se define como virus infectado con células sin el agente de prueba y se considera como 100%.
2.4. Prueba de citotoxicidad in vitro (ensayo MTT)
Se cultivaron células L929 de fibroblastos de pulmón de ratón en medio esencial mínimo completo de Eagle (MEM) y se incubaron a 37 °C ± 1 °C en 5% ± 1% de CO2 . Además, 100 μL de suspensión de células L929 (1 × 10 5células/ml) se transfirió a cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos. Posteriormente, las células se incubaron a 37 °C ± 1 °C durante 24 h ± 2 h. El medio de cultivo se reemplazó con 100 μL de la solución de prueba o control en blanco, positivo o negativo. Las soluciones de prueba contenían 0 (control), 200, 400, 600 y 800 ppm de UC-1 en MEM. El medio de control en blanco contenía suero de caballo al 10%. Las células se incubaron durante otras 24 h. Las células se trataron con las soluciones por triplicado. Después de agregar la solución de MTT a cada pocillo, la placa se incubó durante 2 h ± 10 min a 37 °C ± 1 °C. La solución de MTT se reemplazó con 100 μL de dimetilsulfóxido y posteriormente se sometió a un lector de microplacas equipado con un filtro de 570 nm para medición colorimétrica (referencia, 650 nm). Los resultados por triplicado del ensayo MTT se presentan como media ± desviación estándar (DE). Viabilidad celular (%) = densidad óptica del grupo de prueba/densidad óptica del grupo de control × 100.
2.5. Prueba de irritación ocular de conejo blanco
Se compraron seis conejos blancos hembra de Nueva Zelanda de 2 a 3 kg del Instituto de Investigación Ganadera de Taiwán (Xinhua, Tainan, Taiwán); los conejos fueron puestos en cuarentena y aclimatados antes del tratamiento. Los animales se alimentaron ad libitum y se mantuvieron a 20-26 °C con una humedad del 30% al 70%. Además, se administraron 0,1 ml de 50 ppm de UC-1 (solución de prueba) en el ojo izquierdo de los conejos y 0,1 ml de solución salina normal al 0,9 % (solución de control) en el ojo derecho. Posteriormente, los párpados se mantuvieron juntos durante 1 s para la instilación. Cada tratamiento se repitió tres veces. Se observaron irritaciones oculares a las 1, 24, 48 y 72 horas usando un oftalmoscopio (Welch Allyn, Skaneateles Falls, NY, EE. UU.). La observación extendida fue necesaria en caso de lesiones persistentes para determinar la progresión o reversión de las lesiones. Las puntuaciones de irritación ocular se basaron en el sistema de clasificación de lesiones oculares (ISO 10993-10). Cuando más de un animal en el grupo de prueba mostró un resultado positivo en cualquier etapa de las observaciones, el componente de prueba se consideró irritante para los ojos y no se requirieron ni se realizaron más pruebas. Cuando solo uno de los grupos de prueba mostró una reacción leve o moderada que fue equívoca, el procedimiento se llevó a cabo en tres animales adicionales. Cuando más de la mitad de los ojos mostraban un resultado positivo en cualquier etapa de la observación, el componente de prueba se consideraba irritante para los ojos. Una reacción severa en un solo animal se consideró suficiente para etiquetar el componente de prueba como irritante para los ojos. Cuando más de un animal en el grupo de prueba mostró un resultado positivo en cualquier etapa de las observaciones, el componente de prueba se consideró irritante para los ojos y no se requirieron ni se realizaron más pruebas. Cuando solo uno de los grupos de prueba mostró una reacción leve o moderada que fue equívoca, el procedimiento se llevó a cabo en tres animales adicionales. Cuando más de la mitad de los ojos mostraban un resultado positivo en cualquier etapa de la observación, el componente de prueba se consideraba irritante para los ojos. Una reacción severa en un solo animal se consideró suficiente para etiquetar el componente de prueba como irritante para los ojos. Cuando más de un animal en el grupo de prueba mostró un resultado positivo en cualquier etapa de las observaciones, el componente de prueba se consideró irritante para los ojos y no se requirieron ni se realizaron más pruebas. Cuando solo uno de los grupos de prueba mostró una reacción leve o moderada que fue equívoca, el procedimiento se llevó a cabo en tres animales adicionales. Cuando más de la mitad de los ojos mostraban un resultado positivo en cualquier etapa de la observación, el componente de prueba se consideraba irritante para los ojos. Una reacción severa en un solo animal se consideró suficiente para etiquetar el componente de prueba como irritante para los ojos. Cuando más de la mitad de los ojos mostraban un resultado positivo en cualquier etapa de la observación, el componente de prueba se consideraba irritante para los ojos. Una reacción severa en un solo animal se consideró suficiente para etiquetar el componente de prueba como irritante para los ojos. Cuando más de la mitad de los ojos mostraban un resultado positivo en cualquier etapa de la observación, el componente de prueba se consideraba irritante para los ojos. Una reacción severa en un solo animal se consideró suficiente para etiquetar el componente de prueba como irritante para los ojos.
2.6. Prueba de toxicidad por inhalación
Se compraron quince ratones machos BALB/c de 4 semanas de edad del Centro Nacional de Animales de Laboratorio (Taipei, Taiwán); fueron puestos en cuarentena y aclimatados antes del tratamiento en una sala de animales en la Universidad Médica de China, Taiwán. Los animales fueron alimentados ad libitum y mantenidos a 20-25 °C y 65%-80% de humedad. Se alojaron cinco ratones en una jaula y se alimentaron con 0 (PBS) y 10 o 20 ppm de UC-1 (solución de prueba), que se administró como niebla usando un humidificador en una caja hermética durante 24 h. Se observaron los síntomas clínicos y el peso corporal de los animales; posteriormente fueron sacrificados para examinar las secciones de sus pulmones y el peso de los órganos. Se observaron los animales de experimentación y se registraron sus síntomas clínicos como anormalidad (%), definida como el comportamiento anormal de los animales en comparación con los animales normales, y mortalidad (%), definida como la muerte del animal.
2.6.1. Evaluación del Peso de los Órganos
Durante el experimento, los animales fueron disecados inmediatamente después de la muerte y se realizó un registro. Todos los animales sobrevivientes fueron sacrificados y se les realizó autopsia para observar su apariencia y todos los órganos en la boca, el tórax y las cavidades craneal y abdominal. Posteriormente, los órganos, incluidos el hígado, las glándulas suprarrenales, los riñones y las gónadas, se extrajeron, pesaron y registraron.
2.6.2. Tinción con hematoxilina y eosina de secciones de pulmón de ratón
Las secciones de tejido congeladas en el compuesto de temperatura de corte óptima se fijaron en acetona y cloroformo; las secciones se sumergieron en hematoxilina de Harris filtrada (Leica Biosystems Richmond, Inc., Richmond, IL, EE. UU.) durante 1 min. Los portaobjetos se volvieron a lavar con solución salina tamponada con Tris y Tween 20 (Biokit Biotechnology Inc., Miaoli, Taiwán), y las secciones se contrastaron con eosina (Leica Biosystems Richmond, Inc., Richmond, IL, EE. UU.) durante 1–2 min. Las secciones se deshidrataron en soluciones alcohólicas ascendentes y se aclararon con xileno. Los portaobjetos preparados se examinaron mediante microscopía óptica.
2.7. Prueba de Toxicidad Oral Subcrónica
Veinticinco ratones machos BALB/c de 4 semanas de edad se compraron en el Centro Nacional de Animales de Laboratorio; fueron puestos en cuarentena y aclimatados antes del tratamiento en una sala de animales en la Universidad Médica de China. Los animales se alimentaron ad libitum y se mantuvieron a 20-25 °C con una humedad del 65% al 80%. Se alojaron cinco ratones en una jaula y se alimentaron con 0 (PBS; control), 5, 10, 20 y 40 ppm de UC-1 (soluciones de prueba) continuamente durante 90 días. El PBS o las soluciones de prueba alimentadas como agua potable se prepararon diariamente antes de los tratamientos.
2.7.1. Evaluación de los síntomas clínicos
Se observaron los animales de experimentación y se registraron sus síntomas clínicos como anormalidad (%), definida como el comportamiento anormal de los animales en comparación con los animales normales, y mortalidad (%), definida como la muerte del animal.
2.7.2. Peso corporal
El peso corporal de los animales de experimentación se registró al inicio del tratamiento y una vez por semana durante el período experimental utilizando una balanza electrónica (AND, FX-2000i, Tokio, Japón).
2.7.3. Necropsia, examen macroscópico y pesaje de órganos
Durante el experimento, los animales fueron disecados inmediatamente después de la muerte y se realizó un registro. Todos los animales sobrevivientes fueron sacrificados y se les realizó una autopsia para observar su apariencia, y se analizaron todos los órganos en la boca, el tórax y las cavidades craneal y abdominal. Posteriormente, los órganos, incluidos el hígado, las glándulas suprarrenales, los riñones y las gónadas, se extrajeron, pesaron y registraron.
2.8. Análisis estadístico
Los resultados se analizaron utilizando SPSS Versión 20.0 (IBM Corp., Armonk, NY, EE. UU.) con análisis de varianza unidireccional, prueba F y la nueva prueba de rango múltiple de Duncan para comparar más de dos valores medios; los resultados con p < 0,05 indicaron diferencias significativas. Los resultados representan al menos 3 experimentos independientes y se muestran como la media ± SD.
2.9. Declaración ética
Esta investigación fue aprobada por el Centro de Servicios para Animales de Laboratorio de la Universidad Médica de China. Número de programa: 10442699 (para la prueba de irritación ocular del conejo blanco) y 10442686 (para las pruebas de toxicidad por inhalación y toxicidad oral subcrónica).
3. Resultados
En este estudio, se produjo un UC-1 que contenía 2000 ppm de dióxido de cloro en agua mediante el método electrolítico con sal de calidad alimentaria (99 % NaCl) y agua de ósmosis inversa como reactivos iniciales. Posteriormente, el dióxido de cloro se purificó a través de una película y se disolvió en agua RO. Debido a que una solución de dióxido de cloro se puede aplicar directamente a los alimentos o la higiene humana o las medidas preventivas de salud, se investigó su seguridad y eficacia.
3.1. Prueba de eficacia antimicrobiana
Se examinó la actividad antimicrobiana in vitro de UC-1. La actividad antimicrobiana in vitro fue más del 98,2% de reducción para bacterias y hongos (tabla 1); se observó una excelente actividad antimicrobiana a bajas concentraciones de 5 y 20 ppm de UC-1 para bacterias y hongos, respectivamente.
tabla 1
Eficacia antimicrobiana de UC-1.
| Organismos | Inóculo original (UFC/mL) | Recuentos de UC-1 en el tiempo de contacto a (UFC/mL) | Reducciones porcentuales (R) b |
|---|---|---|---|
| Escherichia coli c, * | 2,55 × 10 5 | <1 | >99,9 |
| Staphylococcus aureus c , * | 3,15 × 10 5 | <1 | >99,9 |
| Pseudomonas aeruginosa c , * | 2,55 × 10 5 | <1 | >99,9 |
| Staphylococcus aureus subsp. Áureo c , * | 2,60 × 10 5 | <1 | >99,9 |
| Bacillus subtilis subespecie c , * | 3,75 × 10 5 | 1,35 × 10 3 | 99.6 |
| Listeria monocytogenes c , * | 8,20 × 10 5 | <1 | >99,9 |
| Acinetobacter baumannii c , * | 5,40 × 10 5 | <1 | >99,9 |
| Salmonella enterica subespecie c , * | 4,80 × 10 5 | <1 | >99,9 |
| Klebsiella pneumoniae c , * | 9.30 × 10 5 | <1 | >99,9 |
| Penicillium funiculosum , c Δ | 3,70 × 10 5 | 6,70 × 10 3 | 98.2 |
| Candida albicans c ,Δ | 3,20 × 10 5 | <1 | >99,9 |
a El tiempo de contacto fue de 10 min. b Las reducciones porcentuales de <1 % no representan bacteriostasis ni fungistasis significativas. c Las concentraciones de UC-1 fueron de 5 y 20 ppm para bacterias y hongos, respectivamente. * presentado como bacteria; Δ presentado como hongos. UFC: unidad formadora de colonias.
3.2. Ensayo antiviral
La actividad antiviral de 0, 25, 50, 100 y 200 ppm de UC-1 después de 2 min de reacción se muestra enFigura 2. Para H1N1 y virus de influenza B/TW/71718/04, 200 ppm de UC-1 tuvieron el efecto más significativo en la inhibición de la formación de placas virales. La concentración inhibitoria máxima media (IC 50 ) de H1N1 fue de 84,65 ± 0,64 ppm y la del virus de la influenza B/TW/71718/04 fue de 95,91 ± 11,61 ppm. Para EV71, 50 ppm de UC-1 mostraron una actividad de inhibición significativa, con un IC 50 de 46,39 ± 1,97 ppm a los 2 min. Se presentan los resultados que muestran significación estadística ( p < 0,05). Las barras se representan como medias ± SD.
Eficacia antiviral contra el virus de la influenza A/WSN/33, el virus de la influenza B/TW/71718/04 y el enterovirus 71. Las barras se representan como media ± desviación estándar (DE). Las medias con la misma letra no difirieron significativamente a p < 0,05 según la prueba F de ANOVA (Análisis de varianza) y la nueva prueba de rango múltiple de Duncan.
3.3. Prueba de citotoxicidad in vitro (ensayo MTT)
Se analizó el efecto citotóxico de 0, 200, 400, 600 y 800 ppm de UC-1 contra células de fibroblastos de pulmón L929. La viabilidad celular fue del 74,0 % al 100,0 % a concentraciones de UC-1 inferiores a 600 ppm. La viabilidad de las células L929 se redujo al 40,3 % a 800 ppm de UC-1 (figura 3).
Efectos citotóxicos de varias concentraciones de UC-1 en células L929.
3.4. Prueba de irritación ocular
La córnea, el iris y las conjuntivas se evaluaron en una prueba de irritación ocular en conejos. La solución de 50 ppm de UC-1 no indujo signos clínicos significativos ni cambios macroscópicos oculares en los conejos en cada punto de tiempo (Tabla 2). Por lo tanto, las aplicaciones oculares únicas con 0,1 mL de 50 ppm de UC-1 no causaron irritación ocular en conejos.
Tabla 2
Grados en la observación clínica de conejos individuales para el ensayo de irritación ocular.
| Regiones aplicadas | Componente de prueba | animales no | Elementos para calificar | Observación clínica (Punto de tiempo/h) | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 24 | 48 | 72 | ||||
| Ojo izquierdo | Prueba (50 ppm UC-1) | RB-160114-01 | Córnea | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Iris | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| conjuntiva | 0 | 1 | 0 | 0 | |||
| RB-160114-03 | Córnea | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Iris | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| conjuntiva | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| RB-160114-06 | Córnea | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Iris | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| conjuntiva | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| Ojo derecho | Control (0,9 % de solución salina) | RB-160114-01 | Córnea | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Iris | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| conjuntiva | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| RB-160114-03 | Córnea | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Iris | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| conjuntiva | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| RB-160114-06 | Córnea | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Iris | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| conjuntiva | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
3.5. Prueba de toxicidad por inhalación
En una prueba de toxicidad por inhalación, usamos 0, 10 y 20 ppm de UC-1, que se administró como niebla usando un humidificador en una caja hermética que contenía cinco ratones. La prueba no mostró anomalías ni mortalidad para los componentes de control y prueba dentro de las 24 h (Tabla 3). Los pesos del corazón, hígado, bazo y riñón del grupo de prueba no diferían significativamente de los del grupo de control (Tabla 4). Tinción con hematoxilina y eosina de las secciones de pulmón de ratones (Figura 4) demostraron que 10 y 20 ppm de UC-1 no indujeron signos clínicos significativos de cambios en las células pulmonares de ratón a las 24 h. Por lo tanto, la inhalación de 10 y 20 ppm de UC-1 no provocó irritación en los ratones.
Tinción con hematoxilina y eosina de secciones de pulmón de ratón en la prueba de toxicidad por inhalación. La barra de escala etiquetada en esta figura era de 100 μm.
Tabla 3
Evaluación de los síntomas clínicos en el ensayo de toxicidad por inhalación.
| Componente de prueba | animales no | Tasa de anormalidad (%) | Mortalidad (%) |
|---|---|---|---|
| Mando: PBS | 5 | 0 | 0 |
| 10 ppm UC-1 | 5 | 0 | 0 |
| 20 ppm UC-1 | 5 | 0 | 0 |
PBS: solución salina tamponada con fosfato.
Tabla 4
Evaluación del peso de los órganos para el ensayo de toxicidad por inhalación.
| Componente de prueba | corazón (g) | hígado (g) | bazo (g) | Riñón (g) |
|---|---|---|---|---|
| Mando: PBS | 0,3 ± 0,1 | 0,7 ± 0,2 | 0,5 ± 0,1 | 0,6 ± 0,1 |
| 10 ppm UC-1 | 0,4 ± 0,1 | 0,7 ± 0,2 | 0,5 ± 0,2 | 0,6 ± 0,2 |
| 20 ppm UC-1 | 0,3 ± 0,2 | 0,8 ± 0,1 | 0,6 ± 0,1 | 0,6 ± 0,2 |
Los análisis estadísticos de los datos presentados se realizaron con un nivel de significación del 95 % ( p < 0,05).
3.6. Prueba de Toxicidad Oral Subcrónica
En la prueba de toxicidad oral subcrónica, se prepararon 0, 5, 10, 20 y 40 ppm de UC-1 para alimentar a los ratones. Las observaciones clínicas de los ratones no mostraron anomalías ni mortalidad después de 90 días para los grupos de control y de prueba (Tabla 5). El peso del ratón no fue influenciado (Figura 5). Además, la necropsia y el examen macroscópico no mostraron ningún síntoma patológico (Figura 6). Los pesos del corazón, hígado, bazo y riñón de los grupos de prueba no difirieron significativamente en comparación con los del grupo de control (Tabla 6). Por lo tanto, la administración de hasta 40 ppm de UC-1 a ratones durante 90 días no es tóxica.
Gráfico de tendencia del peso del ratón en la prueba de toxicidad oral subcrónica. CTL: controlar.
Observación de pulmones y órganos de ratón en el ensayo de toxicidad oral subcrónica.
Tabla 5
Evaluación de los síntomas clínicos en el ensayo de toxicidad oral subcrónica.
| Componente de prueba | animales no | Tasa de anormalidad (%) | Mortalidad (%) |
|---|---|---|---|
| Mando: PBS | 5 | 0 | 0 |
| 5 ppm UC-1 | 5 | 0 | 0 |
| 10 ppm UC-1 | 5 | 0 | 0 |
| 20 ppm UC-1 | 5 | 0 | 0 |
| 40 ppm UC-1 | 5 | 0 | 0 |
Tabla 6
Evaluación del peso de órganos en el ensayo de toxicidad oral subcrónica.
| Componente de prueba | corazón (g) | hígado (g) | bazo (g) | Riñón (g) |
|---|---|---|---|---|
| Mando: PBS | 0,4 ± 0,1 | 0,8 ± 0,2 | 0,5 ± 0,1 | 0,7 ± 0,1 |
| 5 ppm UC-1 | 0,5 ± 0,2 | 0,8 ± 0,3 | 0,6 ± 0,1 | 0,6 ± 0,2 |
| 10 ppm UC-1 | 0,4 ± 0,2 | 0,9 ± 0,1 | 0,5 ± 0,3 | 0,7 ± 0,2 |
| 20 ppm UC-1 | 0,4 ± 0,1 | 0,8 ± 0,2 | 0,5 ± 0,1 | 0,7 ± 0,1 |
| 40 ppm UC-1 | 0,5 ± 0,1 | 0,8 ± 0,3 | 0,5 ± 0,1 | 0,6 ± 0,1 |
Los análisis estadísticos de los datos presentados se realizaron con un nivel de significación del 95 % ( p < 0,05).
4. Discusión
Se preparó UC-1 con dióxido de cloro gaseoso y menos impurezas usando un diseño de proceso verde patentado, y se evaluaron la eficacia y seguridad de UC-1. Muchos estudios han informado de la potente actividad oxidante y antimicrobiana del dióxido de cloro in vitro. Informes recientes han abordado preocupaciones relacionadas con la descontaminación microbiana de alimentos por dióxido de cloro [ 6 , 9 , 18 , 19 , 20 , 21 ]. En estos estudios, el dióxido de cloro se produjo utilizando varios métodos (p. ej., NaClO 2 al 2 % con H 3 PO 4 , Cl 2 al 4 % con NaClO 2 al 80 %,y mediante el uso de un electrogenerador); la actividad antimicrobiana fue superior al 2 % para 5–75 mg/l de ClO 2 en 5–30 min. Aquí, la actividad antimicrobiana tuvo una reducción de más del 98,2 % a concentraciones de UC-1 de 5 y 20 ppm para bacterias y hongos, respectivamente. En la prueba MTT, la viabilidad de las células L929 fue del 93,7 % a 200 ppm de UC-1, una concentración superior al uso habitual.
No se observaron síntomas significativos con 50 ppm de UC-1 en la prueba de irritación ocular. No se observaron anomalías ni mortalidad en los síntomas clínicos, los pulmones y otros órganos a 10 ppm o 20 ppm de UC-1 en la prueba de toxicidad por inhalación. Paulet y Desbrousses [ 22 ] administraron 2,5, 5 y 10 ppm de dióxido de cloro a ratas y conejos en 1970; informaron que 2,5 ppm de dióxido de cloro tenían el nivel más bajo de efectos adversos observados (LOAEL), causando efectos torácicos en ratas a 7 h/día durante 30 días y efectos pulmonares en conejos a 4 h/día durante 45 días. Paulet y Desbrousses [ 23] aumentó la concentración de prueba a 5, 10 y 15 ppm de dióxido de cloro y redujo el tiempo de dosis a 15 min por dosis, 2 a 4 veces al día, durante 4 semanas en ratas. Los resultados mostraron un nivel sin efecto adverso observado (NOAEL) de 5 ppm y un LOAEL de 10 ppm para daño pulmonar.
Los ratones fueron alimentados con agua potable que contenía hasta 40 ppm de UC-1 durante 90 días; la concentración no mostró toxicidad en el ensayo de toxicidad oral subcrónica. Daniel et al. [ 24 ] informó sobre la exposición oral a la toxicidad del dióxido de cloro en el agua potable administrada a ratas Sprague-Dawley durante 90 días; utilizaron diferentes concentraciones de dióxido de cloro (0, 25, 50, 100 y 200 mg/L correspondientes a dosis de 0, 2, 5, 8 y 15 mg/kg·día). El peso del bazo y el hígado disminuyó significativamente a 25 y 50 mg/L, respectivamente. Mostraron lesiones nasales causadas por vapores de dióxido de cloro de 25 mg/L en el agua potable. En ese estudio, el LOAEL fue de 25 mg/L. Bercz et al. [ 25 ] realizó una prueba similar en monos verdes africanos ( Cercopithecus aethiops) usando 0, 30, 100 y 200 mg/L de dióxido de cloro durante 4 a 6 semanas. Además, 200 mg/L de dióxido de cloro causaron eritema y ulceración de la mucosa oral después de 1 semana, y 100 mg/L de dióxido de cloro redujeron los niveles séricos de tiroxina (T4) después de 6 semanas; en ese estudio, el NOAEL fue de 30 mg/L y el LOAEL fue de 100 mg/L para la exposición oral de los monos.
5. Conclusiones
UC-1 se produjo a través de un proceso verde con materiales y procedimientos de partida limpios. La solución UC-1 demostró actividad antibacteriana, antifúngica y antiviral satisfactoria. Se demostró baja toxicidad a través de una prueba de citotoxicidad in vitro (alta IC 50 765 ± 18 ppm), 50 ppm de ClO 2 no causaron irradiación ocular en una prueba de irritación ocular, los ratones no exhibieron anormalidad ni mortalidad en una toxicidad por inhalación de 20 ppm de ClO 2 y las concentraciones de UC-1 de hasta 40 ppm no fueron tóxicas para los ratones durante 90 días en la prueba de toxicidad oral subcrónica. Por lo tanto, se demostró un perfil de seguridad más alto para UC-1 que los arrojados en estudios previos.
Expresiones de gratitud
Agradecemos a Unique Biotech Co. Ltd. por brindar soporte para la solución UC-1. Esta investigación no recibió ninguna subvención específica de agencias de financiación en los sectores público, comercial o sin fines de lucro.
Contribuciones de autor
Hao-Chang Yin y Shan-Shue Wang participaron en el diseño, la discusión, el análisis, la decisión, la revisión y la financiación de la investigación. Jui-Wen Ma y Bin-Syuan Huang procesaron los datos, implementaron la mayoría de los experimentos y escribieron el manuscrito. Chu-Wei Hsu, Chun-Wei Peng y Ming-Long Cheng ayudaron a ejecutar experimentos detallados, así como a recopilar y administrar datos. Jung-Yie Kao y Tzong-Der Way fueron asesores técnicos y coordinadores del estudio y brindaron sugerencias útiles para el diseño experimental, opiniones novedosas para el estudio y colaboración con otros laboratorios.
